RD試劑盒說明結(jié)合物的制法與保存

    我們今天來分析ELISA試劑中相關(guān)結(jié)合物的問題，這是昨天下午一個(gè)來自上海的老師提出來的，做酶標(biāo)記抗體的制備，要說方法主要的來看一共是有兩種。RD試劑盒說明結(jié)合物的制法與保存，下面我們來細(xì)致的了解一下。
    我們剛才說到了主要的兩種方法，先來看*種，戊二醛交聯(lián)法。        
    戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊 二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié) 合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先 將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比 例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較 一步法低。 
    方法二：過碘酸鹽氧化法
    本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，在這上海恒遠(yuǎn)生物說明一下，的比例是：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。  
    看完了兩種制法之后，我們來進(jìn)一步的分析，理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法zui為簡便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。
    用離子交換層析或分子篩分離更為可取，液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得*的分離效果，但費(fèi)用較貴。 
    結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測定的*靈敏度，達(dá)到zui合適的測定條件和測定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽性反應(yīng)的zui高稀釋度。上海恒遠(yuǎn)生物給您舉個(gè)例子吧，我們比如說某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標(biāo)抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測定條件下進(jìn)行“滴配”選擇能達(dá)到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。 
結(jié)合物的保存 
    酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作液。現(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素和防腐劑，以防止細(xì)菌生長。 
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